25-Hydroxycholesterol ใช้ในการศึกษาวิจัยด้านชีววิทยาเซลล์และชีวเคมี โดยเฉพาะในกระบวนการที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์และเมแทบอลิซึมของคอเลสเตอรอล นอกจากนี้ยังใช้เป็นตัวบ่งชี้ทางชีวภาพในการศึกษาการอักเสบและโรคที่เกี่ยวข้องกับระบบภูมิคุ้มกัน ในทางการแพทย์ การวิจัยเกี่ยวกับสารนี้ช่วยให้เข้าใจกลไกการเกิดโรคหลอดเลือดและโรคตับได้ดีขึ้น นอกจากนี้ยังมีการศึกษาเพื่อประเมินบทบาทของมันในกระบวนการ apoptosis และการตอบสนองของเซลล์ต่อความเครียดออกซิเดชัน