สารนี้ถูกนำมาใช้เป็นหลักในการวิจัยทางการแพทย์ โดยเฉพาะในการศึกษาการยับยั้งเอนไซม์ มันทำหน้าที่เป็นตัวยับยั้งที่แรงต่อไดไฮโดรโฟเลตรีดักเตส (DHFR) ซึ่งเป็นเอนไซม์ที่สำคัญในการสังเคราะห์ DNA และการเพิ่มจำนวนเซลล์ โดยการยับยั้ง DHFR จะรบกวนเส้นทางเมแทบอลิซึมของโฟเลต ทำให้มีคุณค่าในการพัฒนายาเคมีบำบัดและยาต้านจุลินทรีย์ การประยุกต์ใช้ขยายไปถึงการตรวจสอบกลไกการดื้อยาของพยาธิชนิดต่าง ๆ เพื่อช่วยในการออกแบบกลยุทธ์การรักษาที่มีประสิทธิภาพมากขึ้น นอกจากนี้ ยังทำหน้าที่เป็นสารกลางสำคัญในการสังเคราะห์โมเลกุลที่ซับซ้อนมากขึ้น เช่น เมโธเทร็กเซต ที่ใช้ในระบบการส่งยาแบบกำหนดเป้าหมาย