เมทิลีนบลูใช้กันอย่างแพร่หลายในวงการแพทย์ในฐานะสีย้อมและยารักษา โดยมักใช้เป็นสารย้อมสีในฮิสโทโลยีเพื่อเน้นโครงสร้างเซลล์ภายใต้กล้องจุลทรรศน์ ช่วยในการวินิจฉัยโรคต่าง ๆ ในทางการแพทย์ ใช้รักษาภาวะเมทฮีโมโกลบินีเมีย ซึ่งเป็นภาวะที่เลือดไม่สามารถขนส่งออกซิเจนได้อย่างมีประสิทธิภาพ โดยแปลงเมทฮีโมโกลบินกลับเป็นฮีโมโกลบิน นอกจากนี้ ยังมีการศึกษาการใช้รักษาการติดเชื้อในระบบทางเดินปัสสาวะและเป็นยาแก้พิษสำหรับการวางยาพิษไซยาไนด์ ในด้านศัลยกรรม ใช้ทำเครื่องหมายบริเวณผ่าตัดหรือตรวจสอบทางเดินของหลอดเลือดและท่อน้ำเหลือง ในงานวิจัย เมทิลีนบลูใช้ในการศึกษาฟังก์ชันไมโตคอนเดรียและความเครียดจากออกซิเดชันเนื่องจากสามารถทำหน้าที่เป็นตัวนำอิเล็กตรอน นอกจากนี้ ยังใช้ในการเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำเป็นสารต้านเชื้อราและปรสิตเพื่อรักษาโรคปลา และเป็นสารต้านจุลินทรีย์ในบางกรณี