5-Azacytosine มีการประยุกต์ใช้หลักในด้านการแพทย์ โดยเฉพาะในการรักษาโรคมะเร็ง เนื่องจากมันสามารถยับยั้งการเมทิลเลชันของดีเอ็นเอ ซึ่งเป็นกระบวนการที่เกี่ยวข้องกับการควบคุมยีน การเปลี่ยนแปลงการเมทิลเลชันของดีเอ็นเอในเซลล์มะเร็งมักทำให้ยีนที่ควบคุมการแบ่งเซลล์ทำงานผิดปกติ 5-Azacytosine ช่วยทำให้ยีนเหล่านี้กลับมาทำงานได้อีกครั้ง โดยเฉพาะยีนที่ยับยั้งการเกิดมะเร็ง นอกจากนี้ สารนี้ยังถูกใช้ในการวิจัยทางชีววิทยาโมเลกุลเพื่อศึกษาบทบาทของการเมทิลเลชันในกระบวนการต่าง ๆ เช่น การพัฒนาของเซลล์ การแสดงออกของยีน และการเปลี่ยนแปลงของเซลล์ต้นกำเนิด ในบางกรณี 5-Azacytosine ยังมีศักยภาพในการใช้รักษาโรคทางพันธุกรรมหรือโรคที่เกี่ยวข้องกับการทำงานผิดปกติของยีนที่เกิดจากการเมทิลเลชันผิดปกติ