เพนิซิลลิเนสถูกนำมาใช้อย่างแพร่หลายในสาขาการแพทย์และเภสัชกรรมเพื่อต่อสู้กับการดื้อยา It is an enzyme that breaks down penicillin antibiotics, rendering them ineffective. คุณสมบัตินี้ถูกนำมาใช้ในห้องปฏิบัติการเพื่อทดสอบความไวของแบคทีเรียต่อยาปฏิชีวนะกลุ่มเพนิซิลลิน โดยการเติมเพนิซิลลิเนสลงในการเพาะปลูกของแบคทีเรีย นักวิจัยสามารถกำหนดได้ว่าแบคทีเรียผลิตเอนไซม์นี้เองหรือไม่ ซึ่งบ่งชี้ถึงการดื้อยาเพนิซิลลิน นอกจากนี้ เพนิซิลลิเนสยังถูกนำมาใช้ในการพัฒนาการบำบัดแบบผสม โดยจับคู่อกับยาปฏิชีวนะเพนิซิลลินเพื่อป้องกันการย่อยสลายโดยแบคทีเรียที่ดื้อ ซึ่งช่วยเพิ่มประสิทธิภาพของการรักษาในผู้ป่วยที่มีการติดเชื้อดื้อยาเพนิซิลลิน ในชุดตรวจวินิจฉัย เพนิซิลลิเนสถูกใช้เพื่อตรวจจับการมีอยู่ของยาปฏิชีวนะกลุ่มเบต้า-แลคตามในตัวอย่าง เพื่อให้มั่นใจในการวิเคราะห์ที่ถูกต้องในสภาพแวดล้อมทางคลินิกและการวิจัย นอกจากนี้ยังใช้ในกระบวนการผลิตยาเพื่อกำจัดเพนิซิลลินที่ปนเปื้อนในตัวอย่างทางชีวภาพ หรือในขั้นตอนการผลิตยาเพื่อให้มั่นใจว่าผลิตภัณฑ์ปลอดจากสารตกค้างของเพนิซิลลิน