เมทโธเทรกเซตถูกใช้อย่างแพร่หลายในการรักษาโรคมะเร็งหลายชนิด รวมถึงมะเร็งเม็ดเลือดขาว มะเร็งต่อมน้ำเหลือง มะเร็งเต้านม และโรค trophoblastic ในครรภ์ เนื่องจากสามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของเซลล์มะเร็ง นอกจากนี้ยังเป็นยาหลักในการจัดการโรคภูมิต้านทานตนเอง เช่น โรคข้ออักเสบรูมาตอยด์ โรคสะเก็ดเงิน และโรคโครห์น โดยช่วยลดการอักเสบและชะลอความก้าวหน้าของโรค นอกจากนี้ เมทโธเทรกเซตยังใช้ในการรักษาการตั้งครรภ์นอกมดลูก และเป็นส่วนหนึ่งของการรักษาเคมีบำบัด คุณสมบัติยับยั้งภูมิคุ้มกันทำให้มีคุณค่าในการป้องกันการปฏิเสธอวัยวะที่ปลูกถ่าย ยานี้ให้ในรูปแบบต่างๆ รวมถึงยาเม็ดรับประทาน การฉีด และการให้ทางหลอดเลือดดำ ขึ้นอยู่กับภาวะที่รักษา