Vancomycin Hydrochloride ใช้เป็นยาปฏิชีวนะในการรักษาการติดเชื้อแบคทีเรียรุนแรง โดยมีประสิทธิภาพสูงต่อการติดเชื้อจากแบคทีเรียแกรมบวก รวมถึง methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) และ Clostridioides difficile

ในสถานพยาบาล มักให้ทางหลอดเลือดดำสำหรับการติดเชื้อรุนแรง เช่น ภาวะติดเชื้อในกระแสเลือด (sepsis), การอักเสบของเยื่อบุหัวใจ (endocarditis) และการติดเชื้อกระดูกหรือข้อ สำหรับอาการท้องเสียที่เกี่ยวข้องกับ C. difficile จะให้ทางรับประทาน

เนื่องจากมีฤทธิ์แรง จึงสงวนไว้สำหรับกรณีที่ยาปฏิชีวนะอื่นไม่ได้ผลหรือมีข้อห้ามใช้ นอกจากนี้ยังใช้ป้องกันการติดเชื้อในผู้ป่วยเสี่ยงสูงระหว่างการผ่าตัด

ต้องมีการตรวจติดตามระหว่างการรักษาเพื่อหลีกเลี่ยงผลข้างเคียง เช่น ความเป็นพิษต่อไต (nephrotoxicity) และพิษต่อหู (ototoxicity) การใช้ยานี้มีความสำคัญในการต่อสู้กับเชื้อดื้อยา ทำให้เป็นเครื่องมือสำคัญในวงการแพทย์สมัยใหม่