อะมพิซิลลินไตรไฮเดรตใช้อย่างแพร่หลายเป็นยาปฏิชีวนะในการรักษาการติดเชื้อแบคทีเรียหลายชนิด มีประสิทธิภาพต่อการติดเชื้อในระบบทางเดินหายใจ ระบบทางเดินปัสสาวะ ระบบทางเดินอาหาร และผิวหนัง นอกจากนี้ยังใช้ในการรักษาเยื่อหุ้มสมองอักเสบ ติดเชื้อในกระแสเลือด และการติดเชื้อรุนแรงอื่นๆ ที่เกิดจากจุลินทรีย์ที่ไวต่อยา ในสัตวแพทย์ใช้รักษาการติดเชื้อแบคทีเรียในสัตว์ นอกจากนี้ยังใช้ในห้องปฏิบัติการสำหรับเตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อเฉพาะเจาะจงเพื่อเพาะเลี้ยงและระบุแบคทีเรียที่ดื้อยาปฏิชีวนะ อาจใช้ป้องกันการติดเชื้อหลังผ่าตัดหรือในผู้ป่วยภูมิคุ้มกันต่ำด้วย มีรูปแบบยาฉีดหรือยารับประทาน และควรใช้ภายใต้คำแนะนำของแพทย์เพื่อป้องกันการดื้อยาและผลข้างเคียง กิจกรรมสเปกตรัมกว้างทำให้เป็นเครื่องมือสำคัญทั้งในคลินิกและการวิจัย