แอมโฟเทอริซิน บี ใช้ในการรักษาการติดเชื้อราในร่างกายที่รุนแรงและเป็นอันตรายถึงชีวิต เช่น การติดเชื้อราในระบบเลือด เนื้อเยื่อ หรืออวัยวะภายใน มักใช้ในผู้ป่วยที่มีระบบภูมิคุ้มกันอ่อนแอ เช่น ผู้ป่วยโรคเอดส์ ผู้ที่ได้รับการปลูกถ่ายอวัยวะ หรือผู้ที่กำลังรับเคมีบำบัด นอกจากนี้ยังใช้ในการรักษาโรคเล็ชมาเนียส ซึ่งเป็นโรคที่เกิดจากปรสิต โดยแอมโฟเทอริซิน บี ออกฤทธิ์ด้วยการทำลายผนังเซลล์ของเชื้อรา ทำให้เชื้อราไม่สามารถดำรงชีวิตได้ อย่างไรก็ตาม ยานี้มีผลข้างเคียงที่รุนแรงได้ จึงต้องใช้ภายใต้การดูแลของแพทย์อย่างใกล้ชิด