26-ไฮดรอกซีคอเลสเตอรอล มีบทบาทสำคัญในกระบวนการเมตาบอลิซึมของคอเลสเตอรอล โดยทำหน้าที่เป็นสารตั้งต้นในการสร้างกรดน้ำดีในตับ ซึ่งช่วยในการย่อยและดูดซึมไขมันในลำไส้เล็ก นอกจากนี้ยังมีส่วนเกี่ยวข้องกับการควบคุมระดับคอเลสเตอรอลในร่างกายผ่านการออกฤทธิ์ต่อตัวรับในนิวเคลียส เช่น LXR (Liver X Receptor) ซึ่งมีผลต่อการควบคุมการดูดซึม การขนส่ง และการขับถ่ายคอเลสเตอรอล

สารนี้ยังถูกศึกษาในด้านการอักเสบและโรคทางระบบประสาท เช่น โรคอัลไซเมอร์ เนื่องจากมีความสามารถในการข้ามผ่านเกราะเลือดและสมอง และอาจมีผลต่อการทำงานของเซลล์สมองและเส้นประสาท โดยเฉพาะอย่างยิ่งในการหมุนเวียนคอเลสเตอรอลในสมอง

ในงานวิจัยทางชีวเคมี 26-ไฮดรอกซีคอเลสเตอรอล ถูกใช้เป็นบ่งชี้ทางชีวภาพ (biomarker) สำหรับภาวะผิดปกติของการเผาผลาญคอเลสเตอรอล โดยเฉพาะในโรคหายากบางชนิดที่เกี่ยวข้องกับการสะสมของสเตอรอลในร่างกาย ระดับที่สูงผิดปกติอาจสัมพันธ์กับความผิดปกติทางเมตาบอลิซึมบางประเภท

นอกจากนี้ สารนี้ยังปรับการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันและการอักเสบ ซึ่งชี้ให้เห็นถึงความเกี่ยวข้องที่เป็นไปได้ในโรคภูมิต้านตนเองและโรคหัวใจและหลอดเลือด