อุปกรณ์และรีเอเจนต์:
ระบบ HPLC (ประกอบด้วยปั๊ม หัวฉีด เสา อุปกรณ์ตรวจจับ และผู้รวมระบบหรือซอฟต์แวร์วิเคราะห์ข้อมูล)
ตัวทำละลายเกรด HPLC (เช่น น้ำ อะซีโตไนไตรล์ กรดไตรฟลูออโรอะซิติก (TFA))
คอลัมน์วิเคราะห์ที่เหมาะสมสำหรับการแยกเปปไทด์ (เช่น คอลัมน์ C18)
เฟสเคลื่อนที่ (โดยทั่วไปใช้คือการไล่ระดับของน้ำ/อะซีโตไนไตรล์ด้วย TFA)
ตัวอย่างเปปไทด์ที่จะวิเคราะห์
มาตรฐานการสอบเทียบ (เป็นทางเลือก สำหรับการวิเคราะห์เชิงปริมาณ)
ขวดและฝา HPLC
ไมโครปิเปตและทิป
ขั้นตอน:
การปรับสมดุลคอลัมน์:
ขับเคลื่อนระบบ HPLC ด้วยเฟสเคลื่อนที่
ปรับสมดุลคอลัมน์กับเฟสเคลื่อนที่ตามคำแนะนำของผู้ผลิต โดยทั่วไป สิ่งนี้เกี่ยวข้องกับการรันเกรเดียนต์ของตัวทำละลาย A (เช่น น้ำที่มี TFA) และตัวทำละลาย B (เช่น อะซีโตไนไตรล์ที่มี TFA) เพื่อให้เกิดความสมดุลของคอลัมน์
การจัดเตรียมตัวอย่าง:
เตรียมสารละลายตัวอย่างเปปไทด์ในตัวทำละลายที่เหมาะสม ตัวทำละลายทั่วไปได้แก่ น้ำ อะซีโตไนไตรล์ หรือส่วนผสมของทั้งสองอย่าง ขึ้นอยู่กับความสามารถในการละลายของเปปไทด์
กรองสารละลายตัวอย่างผ่านตัวกรองเมมเบรน 0.22 μm เพื่อกำจัดอนุภาคที่อาจอุดตันคอลัมน์ HPLC
การฉีด:
ฉีดสารละลายตัวอย่างเปปไทด์ที่ผ่านการกรองในปริมาณที่เหมาะสมลงในระบบ HPLC โดยใช้เครื่องเก็บตัวอย่างอัตโนมัติหรือเครื่องฉีดด้วยตนเอง ปริมาตรการฉีดขึ้นอยู่กับความไวของเครื่องตรวจจับและความเข้มข้นของตัวอย่าง
การชะล้างแบบไล่ระดับ:
รันโปรแกรมการชะล้างแบบเกรเดียนต์โดยใช้เฟสเคลื่อนที่ การไล่ระดับโดยทั่วไปอาจเริ่มต้นด้วยเปอร์เซ็นต์ตัวทำละลาย A ที่สูงกว่า (เช่น 95%) และค่อยๆ เพิ่มตัวทำละลาย B เมื่อเวลาผ่านไป โปรไฟล์การไล่ระดับสีที่แน่นอนขึ้นอยู่กับลักษณะของเปปไทด์ที่กำลังวิเคราะห์
ติดตามสารชะโดยใช้เครื่องตรวจจับที่เหมาะสม เช่น เครื่องตรวจจับ UV-Vis ที่ความยาวคลื่นที่เหมาะสมสำหรับการตรวจจับเปปไทด์ (เช่น 214 นาโนเมตร)
การรวบรวมและการวิเคราะห์ข้อมูล:
รวบรวมข้อมูลโครมาโตกราฟีโดยใช้ซอฟต์แวร์บูรณาการหรือวิเคราะห์ข้อมูลที่เชื่อมต่อกับระบบ HPLC
วิเคราะห์โครมาโตกราฟีเพื่อกำหนดเวลาการคงอยู่ของพีคของเปปไทด์ และการแยกพื้นฐานออกจากสิ่งเจือปนหรือพีคอื่นๆ
คำนวณเปอร์เซ็นต์ความบริสุทธิ์ของเปปไทด์ตามพื้นที่ใต้เส้นโค้ง (AUC) ของพีคของเปปไทด์หลัก สัมพันธ์กับ AUC ทั้งหมดของพีคทั้งหมดในโครมาโตกราฟี
