ใช้หลักๆ ในงานวิจัยทางชีวเคมี สารนี้ทำหน้าที่เป็นสารตั้งต้นสำหรับศึกษากิจกรรมของเอนไซม์ โดยเฉพาะใน assays ที่เกี่ยวข้องกับเอนไซม์โปรตีโอลิติก เช่น trypsin หรือ thrombin ช่วยในการทำความเข้าใจ kinetics และ specificity ของเอนไซม์ เนื่องจากมีกลุ่ม nitroanilide ที่ปล่อยผลิตภัณฑ์สีเมื่อถูกตัด ทำให้ตรวจจับและวัดปริมาณได้ง่าย นอกจากนี้ ยังใช้ในการสังเคราะห์เปปไทด์ในฐานะอนุพันธ์ arginine ที่ได้รับการปกป้องด้วยกลุ่ม Boc (tert-butoxycarbonyl) สำหรับหมู่อะมิโนของ L-arginine ซึ่งช่วยควบคุมการเกิดพันธะเปปไทด์ในโครงสร้างโมเลกุลที่ซับซ้อน การประยุกต์ใช้ขยายไปถึงการพัฒนายา ที่ช่วยในการออกแบบและทดสอบตัวยับยั้งเอนไซม์ โดยกลุ่ม 4-nitroanilide ช่วยในการติดตามปฏิกิริยาได้อย่างมีประสิทธิภาพ