เมทิลีนบลูใช้ในการแพทย์เพื่อเป็นสารช่วยวินิจฉัยและรักษาโรคต่างๆ เช่น การตรวจสอบระบบทางเดินปัสสาวะ โดยใช้เพื่อตรวจหาการรั่วไหลของปัสสาวะ นอกจากนี้ยังใช้ในการรักษาภาวะเมทฮีโมโกลบินีเมีย ซึ่งเป็นภาวะที่เลือดไม่สามารถขนส่งออกซิเจนได้อย่างมีประสิทธิภาพ ในด้านจุลชีววิทยา เมทิลีนบลูใช้เป็นสารย้อมสีเพื่อช่วยในการตรวจสอบและแยกแยะเชื้อแบคทีเรียและเซลล์ภายใต้กล้องจุลทรรศน์ นอกจากนี้ยังใช้ในการวิจัยทางวิทยาศาสตร์เพื่อศึกษากระบวนการออกซิเดชันและรีดักชันในเซลล์