เพนิซิลลิน V ใช้เป็นยาปฏิชีวนะในการรักษาการติดเชื้อแบคทีเรียหลายชนิด โดยเฉพาะเชื้อแกรมบวก เช่น การติดเชื้อสเตรปโตคอคคัสในลำคอ (strep throat) และการติดเชื้อในระบบทางเดินหายใจระดับเบาถึงปานกลาง นอกจากนี้ยังใช้เป็นยาป้องกันในผู้ป่วยที่มีประวัติไข้รูมาติกเพื่อป้องกันการติดเชื้อสเตรปโตคอคคัสซ้ำ และอาจใช้รักษาการติดเชื้อในช่องปากหรือฟันบางชนิด

เพนิซิลลิน V มีความคงทนต่อกรด จึงดูดซึมได้ดีทางเดินอาหารและมักใช้ในรูปแบบรับประทาน เหมาะสำหรับการรักษาผู้ป่วยนอกที่ไม่จำเป็นต้องนอนโรงพยาบาล เพนิซิลลิน V ไม่มีประสิทธิภาพต่อแบคทีเรียที่ผลิตเบต้า-แลคตาเมส และโดยทั่วไปไม่ใช้สำหรับการติดเชื้อรุนแรงหรือระบบ โดยจำกัดการใช้ในกรณีการติดเชื้อเบาที่เชื้อก่อโรคไวต่อเพนิซิลลินและเหมาะสมกับการรักษาทางปาก

โดยทั่วไปมีความปลอดภัยสูงและผลข้างเคียงน้อย แต่อาจเกิดอาการแพ้ในบางคน เช่น ผื่น หรือปฏิกิริยาการแพ้รุนแรงในผู้ที่มีประวัติแพ้เพนิซิลลิน