ใช้รักษาการติดเชื้อแบคทีเรียที่ไวต่อเพนิซิลลิน โดยเฉพาะเชื้อสแตฟฟิโลคัคคัส แอรูอัส (Staphylococcus aureus) ที่ผลิตเพนิซิลลิเนส ซึ่งดื้อต่อเพนิซิลลินจีได้ นีฟาซิลลินทำงานโดยยับยั้งการสร้างผนังเซลล์ของแบคทีเรีย ทำให้แบคทีเรียตาย มักใช้ในรูปแบบฉีดเข้ากล้ามเนื้อหรือเข้าหลอดเลือด สำหรับการติดเชื้อที่รุนแรง เช่น ติดเชื้อในกระแสเลือด หัวใจ กระดูก หรือปอด มีความเข้ากันได้ดีกับผู้ป่วยที่ไม่สามารถใช้ยาปฏิชีวนะชนิดอื่นได้ และมักใช้ในโรงพยาบาลมากกว่าการรักษาที่บ้าน