เมทิลีนบลูไฮเดรตใช้อย่างแพร่หลายในสาขาการแพทย์ ชีววิทยา และเคมี ในทางการแพทย์ ทำหน้าที่เป็นยาแก้พิษสำหรับภาวะเมทฮีโมโกลบินในเลือดที่เกิดจากสารพิษ เช่น ไนไตรต์หรือคลอเรต ซึ่งทำให้เลือดไม่สามารถขนส่งออกซิเจนได้อย่างมีประสิทธิภาพ นอกจากนี้ยังใช้รักษาภาวะพิษจากไซยาไนด์และภาวะช็อกจากการติดเชื้อ (vasoplegic หรือ septic shock) ในกระบวนการวินิจฉัย เช่น การย้อมสีเนื้อเยื่อเพื่อตรวจสอบใต้กล้องจุลทรรศน์ ช่วยเน้นโครงสร้างเซลล์ ในจุลชีววิทยา ทำหน้าที่เป็นสารย้อมสีสำคัญเพื่อแยกแยะเซลล์ที่มีชีวิตและเซลล์ที่ตายแล้ว ในทางทันตกรรม ใช้เป็นสารฆ่าเชื้อในช่องปากและรักษาแผลในปาก นอกจากนี้ยังใช้ในสถานการณ์ผ่าตัดเพื่อทำเครื่องหมายเนื้อเยื่อหรือเป็นสีย้อมในขั้นตอนต่าง ๆ นอกเหนือจากทางการแพทย์ ใช้ในการเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำเพื่อรักษาการติดเชื้อราและปรสิตในปลา ในกระบวนการทางวิทยาศาสตร์ ทำหน้าที่เป็นตัวบ่งชี้ในปฏิกิริยาออกซิเดชัน-รีดักชัน (redox indicator) ความหลากหลายทำให้เป็นเครื่องมือที่มีคุณค่าในสภาพแวดล้อมทางคลินิก การวิจัย และอุตสาหกรรม