5,10-เมทิลีนเทตระไฮโดรโฟเลต มีบทบาทสำคัญในเมแทบอลิซึมคาร์บอนหนึ่งหน่วย โดยทำหน้าที่เป็นตัวกลางสำคัญในการสังเคราะห์นิวคลีโอไทด์ มันจำเป็นสำหรับการแปลง deoxyuridine monophosphate (dUMP) เป็น deoxythymidine monophosphate (dTMP) ซึ่งเป็นกระบวนการที่สำคัญสำหรับการทำซ้ำและซ่อมแซม DNA ทำให้มีความสำคัญต่อการแบ่งเซลล์และการเจริญเติบโต โดยเฉพาะในเซลล์ที่แบ่งตัวอย่างรวดเร็ว เช่น ในไขกระดูกและเยื่อบุลำไส้

ในการวิจัยทางการแพทย์ มันถูกศึกษาในบทบาทของเมแทบอลิซึมโฟเลตและผลกระทบที่อาจเกิดขึ้นต่อภาวะเช่น มะเร็ง โรคหัวใจและหลอดเลือด และความผิดปกติของท่อประสาท นอกจากนี้ยังเกี่ยวข้องกับการทำความเข้าใจประสิทธิภาพของยาต้านโฟเลต ซึ่งเล็งเป้าไปที่เส้นทางที่ขึ้นกับโฟเลตในมะเร็งและการติดเชื้อแบคทีเรีย นอกจากนี้ ระดับของมันยังถูกตรวจสอบในกรณีขาดโฟเลตหรือการกลายพันธุ์ทางพันธุกรรมที่กระทบต่อเมแทบอลิซึมโฟเลต เช่น ตัวแปรยีน MTHFR