เมทิลีนบลูถูกใช้อย่างแพร่หลายในวงการแพทย์ในฐานะสีย้อมและยารักษา ใช้ในการผ่าตัดเพื่อช่วยระบุเนื้อเยื่อ เช่น การมองเห็นต่อมพาราไทรอยด์ และเป็นสารย้อมในขั้นตอนวินิจฉัย เช่น การย้อมแกรมสำหรับแบคทีเรีย นอกจากนี้ยังใช้เป็นยาแก้พิษสำหรับเมทฮีโมโกลบินีเมีย สภาวะที่เลือดไม่สามารถขนส่งออกซิเจนได้อย่างมีประสิทธิภาพ ในจุลชีววิทยา ใช้ทดสอบความมีชีวิตของเซลล์และการหายใจ นอกจากนี้ยังมี ứng dụngในการเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำเพื่อรักษาการติดเชื้อราในปลา และเป็นสารย้อมในฮิสโทโลยีเพื่อเน้นโครงสร้างเซลล์ ในทางเคมี ใช้เป็นตัวบ่งชี้รีดอกซ์ในกระบวนการวิเคราะห์ การวิจัยยังสำรวจศักยภาพในการรักษาโรคเสื่อมถอยของระบบประสาทและเป็นสารต้านไวรัส