ใช้เป็นตัวบ่งชี้รีดอกซ์ในเคมีวิเคราะห์ โดยเมทิลีนบลูไตรไฮเดรตมีบทบาทสำคัญในการไทเทรตที่เปลี่ยนสีตามสถานะออกซิเดชันของสารละลาย

นำมาใช้ในการย้อมสีทางชีวภาพเพื่อแยกแยะเซลล์และโครงสร้างเซลล์ใต้กล้องจุลทรรศน์ โดยเฉพาะในจุลชีววิทยาและพยาธิวิทยา

ในทางการแพทย์ ใช้เป็นยาต้านพิษสำหรับเมธีมีโมโกลบินีเมีย โดยช่วยเปลี่ยนเมธีมีโมโกลบินกลับเป็นฮีโมโกลบิน นอกจากนี้ยังใช้ในโฟโตไดนามิกเทอราพี ในฐานะโฟโตเซนซิไทเซอร์เพื่อทำลายพาธาเจนในผลิตภัณฑ์เลือดหรือรักษาการติดเชื้อบางชนิด

ในเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำและการแพทย์สัตว์ ทำหน้าที่เป็นสารต้านเชื้อราและต้านปรสิตสำหรับปลาและไข่ นอกจากนี้ยังใช้ในการย้อมสีสิ่งทอและกระดาษเนื่องจากคุณสมบัติการย้อมสีที่แรง และในกระบวนการบำบัดน้ำ

ในงานวิจัยชีวเคมี ใช้เป็นตัวรับอิเล็กตรอนในการศึกษากระบวนการถ่ายโอนอิเล็กตรอน และในการทดลองปฏิกิริยาโฟโตเคมีหรือการผลิตพลังงานจากแสง