เมทิลีนบลูใช้กันอย่างแพร่หลายในสถานพยาบาลเป็นเครื่องมือวินิจฉัยและการรักษา ใช้ในการผ่าตัดเพื่อช่วยระบุเนื้อเยื่อและโครงสร้างบางอย่าง เช่น ต่อมพาราไทรอยด์ เนื่องจากคุณสมบัติการย้อมสี นอกจากนี้ ยังใช้รักษาภาวะเมทฮีโมโกลบินในเลือด ซึ่งเป็นภาวะที่เลือดไม่สามารถลำเลียงออกซิเจนได้อย่างมีประสิทธิภาพ โดยแปลงเมทฮีโมโกลบินกลับเป็นฮีโมโกลบิน ในทางจุลชีววิทยา เมทิลีนบลูใช้เป็นสีย้อมเพื่อเพิ่มความชัดเจนของจุลินทรีย์ภายใต้กล้องจุลทรรศน์ ยังใช้ในอุตสาหกรรมเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำเพื่อรักษาการติดเชื้อราในปลาและไข่ของปลา นอกจากนี้ เมทิลีนบลูมีคุณสมบัติในทางเคมีเป็นตัวบ่งชี้รีดอกซ์ในการทดลองไทเทรชัน