อีโอซิน บี ถูกใช้อย่างแพร่หลายเป็นสีย้อมทางชีววิทยาในฮิสโทโลยีและไซโทโลยีเพื่อเน้นโครงสร้างเซลล์ภายใต้กล้องจุลทรรศน์ โดยมีประสิทธิภาพสูงในการย้อมไซโทพลาซึม คอลลาเจน และเส้นใยกล้ามเนื้อ มักใช้คู่กับฮีมาโตซิลินในวิธีการย้อม H&E สำหรับตัวอย่างเนื้อเยื่อ นอกจากนี้ยังใช้ในกระบวนการย้อมสีทางฮีมาโตโลยีเพื่อช่วยในการวิเคราะห์เซลล์เม็ดเลือดและตรวจหาความผิดปกติต่าง ๆ ในทางการแพทย์ ในอุตสาหกรรมสิ่งทอ ใช้เป็นสีย้อมสำหรับผ้า ให้สีแดงหรือชมพูที่สดใส อีกทั้งยังใช้ในอุตสาหกรรมกระดาษเพื่อย้อมสีผลิตภัณฑ์กระดาษ ในวิทยาศาสตร์นิติวิทยา ใช้เป็นตัวบ่งชี้สำหรับตรวจจับลายนิ้วมือที่ซ่อนอยู่บนพื้นผิวพรุน ในจุลชีววิทยา ช่วยในการแยกแยะโคโลนีแบคทีเรียในอาหารเลี้ยงเชื้อบางชนิด คุณสมบัติเรืองแสงทำให้มีประโยชน์ในกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงสำหรับการมองเห็นส่วนประกอบชีวภาพเฉพาะ และบางครั้งใช้ในงานวิจัยทางวิทยาศาสตร์เพื่อศึกษาปฏิกิริยาเคมีหรือกระบวนการทางชีวเคมี