เมทิลีนบลู เอ็น ใช้กันอย่างแพร่หลายในสถานพยาบาลเป็นเครื่องมือวินิจฉัยและสารรักษา ในด้านการวินิจฉัยทางคลินิก ใช้เป็นสารย้อมสีเพื่อระบุแบคทีเรีย พยาธิ และส่วนประกอบของเซลล์บางชนิดภายใต้กล้องจุลทรรศน์ มีประสิทธิภาพสูงในการเน้นเซลล์และเนื้อเยื่อที่ยังมีชีวิต ทำให้มีคุณค่าในด้านฮิสโทโลยีและพยาธิวิทยา นอกจากนี้ ยังใช้ในการรักษาภาวะเมทฮีโมโกลบินในเลือด (methemoglobinemia) ซึ่งเป็นภาวะที่เลือดไม่สามารถขนส่งออกซิเจนได้อย่างมีประสิทธิภาพ โดยการแปลงเมทฮีโมโกลบินกลับเป็นฮีโมโกลบิน เมทิลีนบลู เอ็น ยังถูกนำมาใช้ในการรักษาอาการพิษจากไซยาไนด์ โดยช่วยในการฟื้นฟูการทำงานของเซลล์และระบบหายใจ ในขั้นตอนการผ่าตัด ใช้เป็นสีย้อมเพื่อทำเครื่องหมายเนื้อเยื่อหรือโครงสร้าง ช่วยเพิ่มความแม่นยำในการผ่าตัด นอกเหนือจากทางการแพทย์ ใช้ในการเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำเพื่อรักษาการติดเชื้อราในปลาและไข่ของพวกมัน การประยุกต์ใช้ยังขยายไปสู่การวิจัย ที่ซึ่งทำหน้าที่เป็นตัวบ่งชี้ redox ในงานทดลองทางชีวเคมี