2-Nitrophenyl β-D-glucopyranoside ใช้เป็นสารตั้งต้นในการศึกษาปฏิกิริยาเอนไซม์ โดยเฉพาะอย่างยิ่งในการวิเคราะห์กิจกรรมของเอนไซม์ β-glucosidase ซึ่งเป็นเอนไซม์ที่เกี่ยวข้องกับการย่อยสลายสารประกอบกลูโคไซด์ ในกระบวนการทดลอง สารนี้จะถูกย่อยสลายโดยเอนไซม์ β-glucosidase ให้เป็นกลูโคสและ 2-ไนโตรฟีนอล ซึ่ง 2-ไนโตรฟีนอลสามารถวัดได้ง่ายด้วยวิธีการสเปกโตรโฟโตเมทรี ทำให้สามารถประเมินกิจกรรมของเอนไซม์ได้อย่างแม่นยำ นอกจากนี้ยังใช้ในการวิจัยทางชีวเคมีเพื่อศึกษากลไกการทำงานของเอนไซม์และพัฒนาวิธีการตรวจวัดทางชีวภาพ นอกจากนี้ ยังใช้เป็นสารตัวอย่างในงานศึกษาการย่อยสลายกลูโคไซด์ ช่วยในการพัฒนายับยั้งหรือกระตุ้นเอนไซม์สำหรับวัตถุประสงค์ทางการบำบัดหรืออุตสาหกรรม การประยุกต์ใช้ขยายไปยังสาขาชีววิทยาพืช ซึ่งใช้ในการตรวจสอบการเผาผลาญกลูโคไซด์ในพืช