ortho-iodoHoechst 33258 ใช้ในการศึกษาด้านชีววิทยาโมเลกุล โดยเฉพาะการย้อมสีดีเอ็นเอเพื่อการวิเคราะห์ด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบฟลูออเรสเซนต์ สารนี้มีความสามารถในการจับกับดีเอ็นเอแบบ AT-rich ทำให้สามารถใช้ในการตรวจสอบโครงสร้างและการจัดเรียงตัวของโครโมโซมในเซลล์ นอกจากนี้ยังมีบทบาทในการวิจัยเกี่ยวกับกลไกการทำงานของยีนและการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรม เช่น การกลายพันธุ์หรือการเสียหายของดีเอ็นเอ ortho-iodoHoechst 33258 ยังถูกนำมาใช้ในการทดสอบประสิทธิภาพของสารต้านมะเร็งและยาที่มีผลต่อดีเอ็นเออีกด้วย