4,5-Dichlorofluorescein ใช้หลักๆ เป็นสารตรวจสอบเรืองแสงในแอปพลิเคชันต่างๆ โดยมีประสิทธิภาพสูงในการตรวจจับรอยรั่วในระบบประปาและอุปกรณ์อุตสาหกรรม คุณสมบัติเรืองแสงที่แข็งแกร่งภายใต้แสง UV ทำให้เหมาะสมสำหรับการระบุรอยรั่วเล็กน้อยในระบบน้ำและน้ำมัน ในงานวิจัยทางชีววิทยา ทำหน้าที่เป็นสีย้อมสำคัญสำหรับการแสดงภาพกระบวนการเซลล์และการติดตามการเคลื่อนที่ของของเหลวในเนื้อเยื่อ นอกจากนี้ ยังใช้ในการศึกษาสิ่งแวดล้อมเพื่อตรวจสอบการไหลของน้ำและการปนเปื้อนในแหล่งน้ำธรรมชาติ ความเสถียรและความไวช่วยให้ได้ผลลัพธ์ที่เชื่อถือได้ในทั้งการตั้งค่าอุตสาหกรรมและวิทยาศาสตร์