6-Nitrofluorescein (isomer II) ถูกใช้อย่างแพร่หลายเป็นตัวตรวจสอบเรืองแสงในงานศึกษาทางชีวเคมีและเซลล์ คุณสมบัติการเรืองแสงที่แข็งแกร่งทำให้มีคุณค่าต่อการติดฉลากและติดตามโมเลกุลในระบบชีวภาพต่างๆ มักใช้ในกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงเพื่อแสดงภาพโครงสร้างและกระบวนการของเซลล์ ให้ข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับพลวัตและปฏิสัมพันธ์ของเซลล์ นอกจากนี้ยังทำหน้าที่เป็นตัวบ่งชี้ที่ไวต่อ pH ช่วยวัดและตรวจสอบการเปลี่ยนแปลง pH ในระบบทดลอง การประยุกต์ใช้ขยายไปถึงการทดสอบกิจกรรมเอนไซม์ ซึ่งทำหน้าที่เป็นสารตั้งต้นหรือโมเลกุลผู้รายงาน ทำให้สามารถตรวจจับปฏิกิริยาเอนไซม์เฉพาะเจาะจง สารประกอบนี้ยังถูกใช้ในงานวิจัยที่เกี่ยวข้องกับความเครียดออกซิเดชัน เนื่องจากสามารถใช้ตรวจจับและวัดปริมาณสปีชีส์ออกซิเจนปฏิกิริยา