Trimetrexate ใช้หลักในการเป็นยาต้านปรสิตและยาต้านมะเร็ง โดยยับยั้งเอนไซม์ dihydrofolate reductase ซึ่งจำเป็นสำหรับการสังเคราะห์ DNA ทำให้มีประสิทธิภาพในการกำหนดเป้าหมายเซลล์ที่แบ่งตัวอย่างรวดเร็ว ในสถานพยาบาล ใช้รักษาปอดอักเสบจาก Pneumocystis pneumonia (PCP) โดยเฉพาะในผู้ป่วยที่มีระบบภูมิคุ้มกันบกพร่อง เช่น ผู้ป่วย HIV/AIDS นอกจากนี้ ยังมีการศึกษาความเป็นไปได้ในการรักษามะเร็งบางชนิด รวมถึงมะเร็งเม็ดเลือดขาวและเนื้องอกแข็ง เนื่องจากความสามารถในการรบกวนการเพิ่มจำนวนเซลล์ การใช้มักต้องให้ leucovorin ร่วมด้วยเพื่อปกป้องเซลล์ปกติจากผลข้างเคียงที่เป็นพิษต่อเซลล์