ริฟามัยซินใช้รักษาการติดเชื้อแบคทีเรีย โดยเฉพาะวัณโรคและโรคเรื้อน (leprosy) มีฤทธิ์ต่อต้านแบคทีเรียแกรมบวกและบางชนิดของแบคทีเรียแกรมลบ โดยออกฤทธิ์ยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ RNA polymerase ที่ขึ้นกับ DNA ทำให้แบคทีเรียไม่สามารถสังเคราะห์ RNA ได้ ส่งผลให้หยุดการเจริญเติบโตและการแพร่พันธุ์ นิยมใช้ร่วมกับยาปฏิชีวนะอื่นเพื่อป้องกันการดื้อยา โดยเฉพาะในผู้ป่วยวัณโรค นอกจากนี้ ยังใช้ป้องกันการติดเชื้อ meningococcal meningitis ในผู้ใกล้ชิด และใช้ในการป้องกันก่อนการผ่าตัด ริฟามัยซินใช้ในรูปแบบยาทาหรือยาหยอดตาสำหรับการติดเชื้อที่ผิวหนังหรือตา และใช้ในสัตว์การแพทย์