เมทิซิลลินเป็นยาปฏิชีวนะที่ใช้หลักในการรักษาการติดเชื้อที่เกิดจากแบคทีเรียแกรมบวก โดยเฉพาะเชื้อที่ดื้อยาเพนนิซิลลินอื่นๆ มีประสิทธิภาพต่อ Staphylococcus aureus รวมถึงสายพันธุ์ที่ผลิต penicillinase ซึ่งเป็นเอนไซม์ที่ทำให้ยาบางชนิดสูญเสียฤทธิ์ เมทิซิลลินทำงานโดยยับยั้งการสังเคราะห์ผนังเซลล์แบคทีเรีย ทำให้เกิดการแตกของเซลล์และตาย

เนื่องจากไม่เสถียรในสภาพแวดล้อมกรด เมทิซิลลินจึงไม่สามารถให้ทางปากได้ ต้องให้โดยการฉีด และใช้หลักในโรงพยาบาลสำหรับการติดเชื้อรุนแรง เช่น septicemia, endocarditis และการติดเชื้อกระดูกหรือข้อที่เกิดจากเชื้อที่ไวต่อยา

เนื่องจากความเสี่ยงต่อการแพ้และการเกิด methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) รวมถึงปัญหาความเป็นพิษต่อไต การใช้เมทิซิลลินในทางคลินิกจึงลดลง ถูกแทนที่ด้วยยาปฏิชีวนะที่เสถียรกว่าและมีประสิทธิภาพดีกว่า อย่างไรก็ตาม เมทิซิลลินมีบทบาทสำคัญทางประวัติศาสตร์ในการพัฒนาเพนนิซิลลินที่ทนต่อ penicillinase และในการทำความเข้าใจการดื้อยาปฏิชีวนะ