ซิโตรไมซินถูกนำมาใช้อย่างแพร่หลายในอุตสาหกรรมยาเนื่องจากคุณสมบัติต้านจุลชีพที่แรง โดยนำไปใช้หลักในการรักษาการติดเชื้อแบคทีเรีย โดยเฉพาะที่เกิดจากสิ่งมีชีวิตแกรมบวก ประสิทธิภาพในการยับยั้งการสังเคราะห์โปรตีนในแบคทีเรียทำให้เป็นส่วนประกอบที่มีคุณค่าในสูตรยาปฏิชีวนะแบบ broad-spectrum

ในสัตวแพทย์ ซิโตรไมซินใช้จัดการกับการติดเชื้อทางเดินหายใจ ทางเดินปัสสาวะ และผิวหนังในปศุสัตว์และสัตว์เลี้ยงคู่ มักให้ทางปากหรือฉีด ขึ้นอยู่กับสูตรและชนิดสัตว์เป้าหมาย

สารนี้ยังนำไปใช้ในเกษตรกรรมเป็นตัวกระตุ้นการเจริญเติบโตและป้องกันโรคในสัตว์ปีกและเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำ อย่างไรก็ตาม การใช้ถูกควบคุมเพื่อป้องกันการพัฒนาการดื้อยา

นอกจากนี้ ซิโตรไมซินยังใช้ในงานวิจัยสำหรับการคัดเลือกจุลชีพในเซลล์เพาะเลี้ยงและวิศวกรรมพันธุกรรม โดยเฉพาะในการบำรุงพลาสมิดที่ใช้ยีนดื้อยาเป็นตัวบ่งชี้