5-Fluorouracil ถูกใช้อย่างแพร่หลายในการรักษาโรคมะเร็งหลายชนิด รวมถึงมะเร็งลำไส้ใหญ่ มะเร็งเต้านม มะเร็งกระเพาะอาหาร และมะเร็งตับอ่อน โดยยับยั้งการสังเคราะห์ DNA และ RNA ซึ่งป้องกันไม่ให้เซลล์มะเร็งเติบโตและแบ่งตัว ในด้านโรคผิวหนัง ใช้ทาเฉพาะที่เพื่อรักษาโรคหนังแข็งจากแสงแดด (actinic keratosis) และมะเร็งผิวหนังบางชนิด เช่น มะเร็งเซลล์ฐานตื้น นอกจากนี้ ยังใช้ร่วมกับยาเคมีบำบัดอื่นๆ เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพในการต่อสู้กับมะเร็งที่รุนแรงมากขึ้น ความสามารถในการกำหนดเป้าหมายเซลล์ที่แบ่งตัวเร็วทำให้เป็นเครื่องมือที่มีค่าในการบำบัดมะเร็งทั้งแบบระบบและแบบเฉพาะที่