คลอแรมเฟนิคอลใช้เป็นยาปฏิชีวนะสำหรับรักษาการติดเชื้อแบคทีเรียหลายชนิด มีประสิทธิภาพต่อแบคทีเรียหลากหลาย ทำให้เหมาะสำหรับรักษาโรค เช่น โรคเยื่อหุ้มสมองอักเสบ โรคไทฟอยด์ การติดเชื้อในระบบทางเดินหายใจ การติดเชื้อที่ตา และการติดเชื้อที่ผิวหนัง ในรูปแบบยาหยอดตาและยาทาผิวหนัง ในสัตว์แพทย์ ใช้รักษาการติดเชื้อในสัตว์ เนื่องจากสามารถซึมผ่านเนื้อเยื่อได้ดี จึงมีคุณค่าในการรักษาการติดเชื้อในบริเวณที่เข้าถึงยาก เช่น สมองและตา อย่างไรก็ตาม การใช้มักจำกัดในกรณีรุนแรงเนื่องจากผลข้างเคียงที่อาจเกิดขึ้น เช่น การกดการสร้างเม็ดเลือดในไขกระดูก ซึ่งอาจนำไปสู่ภาวะเม็ดเลือดขาวต่ำ ควรใช้ด้วยความระมัดระวังและภายใต้คำแนะนำของแพทย์เท่านั้น นอกจากนี้ ยังใช้ในงานวิจัย โดยเฉพาะในชีววิทยาโมเลกุลเป็นสารเลือกในการแยกเซลล์ที่ถูกดัดแปลงพันธุกรรม