ใช้โรดามีน บี เป็นสีย้อมในอุตสาหกรรมสิ่งทอและพลาสติก เนื่องจากให้สีแดงสดและเรืองแสงได้ดี มักใช้ในงานวิจัยทางชีววิทยาและจุลชีววิทยาเพื่อติดฉลากเซลล์หรือโปรตีนเพราะสามารถเรืองแสงเมื่อส่องด้วยแสงยูวี นิยมใช้ในเทคนิคไมโครสโคปีฟลูออเรสเซนส์เพื่อสังเกตการกระจายตัวของสารในเซลล์ นอกจากนี้ยังใช้เป็นตัวติดตามการไหลของน้ำในระบบน้ำใต้ดินหรือแหล่งน้ำธรรมชาติเนื่องจากตรวจจับได้ง่ายในความเข้มข้นต่ำ อย่างไรก็ตาม ห้ามใช้ในเครื่องสำอางหรืออาหารเนื่องจากมีพิษและอาจก่อมะเร็ง