โรดามีน บี ถูกนำมาใช้อย่างแพร่หลายในฐานะสีย้อมเรืองแสงในแอปพลิเคชันต่างๆ ในงานวิจัยทางชีววิทยา ใช้สำหรับย้อมเซลล์และเนื้อเยื่อเพื่อศึกษาคุณสมบัติและกระบวนการของเซลล์ภายใต้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง นอกจากนี้ยังใช้ใน flow cytometry เพื่อติดฉลากและติดตามเซลล์เฉพาะ ในอุตสาหกรรมสิ่งทอ โรดามีน บี ใช้เป็นสีย้อมสำหรับผ้า เพื่อให้สีสันสดใส นอกจากนี้ยังใช้ในการผลิตหมึก สีทา และสารเคลือบ เพื่อให้ได้สีสันสดใสและคงทน ในงานศึกษาสิ่งแวดล้อม ทำหน้าที่เป็นตัวติดตามเพื่อตรวจสอบการไหลของน้ำและการกระจายของมลพิษในแม่น้ำและน้ำใต้ดิน คุณสมบัติเรืองแสงทำให้มีคุณค่าในเทคโนโลยีเลเซอร์สำหรับการปรับแต่งและสอบเทียบ อย่างไรก็ตาม เนื่องจากมีศักยภาพในการเป็นพิษ การใช้ในอาหาร เครื่องสำอาง และเภสัชกรรมจึงอยู่ภายใต้การควบคุมอย่างเข้มงวด