ใช้โปรฟลาวีนเฮมีซัลเฟตในทางการแพทย์เป็นยาฆ่าเชื้อชนิดหนึ่ง โดยเฉพาะสำหรับแผลติดเชื้อแบคทีเรีย เนื่องจากมีฤทธิ์ต้านจุลชีพต่อแบคทีเรียแกรมบวกและบางชนิดของแบคทีเรียแกรมลบ นิยมใช้ในรูปของผงโรยแผล หรือสารละลายล้างแผล ช่วยป้องกันการติดเชื้อและส่งเสริมการรักษาแผล โดยเฉพาะในกรณีแผลไฟไหม้ น้ำร้อนลวก หรือแผลเปิดขนาดเล็ก นอกจากนี้ยังมีการใช้ในห้องปฏิบัติการวิจัยเกี่ยวกับชีววิทยาโมเลกุล เช่น การย้อมสีดีเอ็นเอในระหว่างการศึกษาโครงสร้างของกรดนิวคลีอิก