5α-Cholestane ใช้หลักๆ เป็นสารมาตรฐานอ้างอิงในการวิเคราะห์ทางเคมี โดยเฉพาะในก๊าซโครมาโทกราฟีและสเปกโตรเมตรีมวลสาร เพื่อระบุและวัดปริมาณสเตอรอลและสารประกอบที่เกี่ยวข้องในตัวอย่างทางชีวภาพ ทำหน้าที่เป็นตัวบ่งชี้หลักในการศึกษาการเผาผลาญคอเลสเตอรอลและการวิเคราะห์เส้นทางชีวสังเคราะห์สเตอรอล นอกจากนี้ ยังใช้ในการวิจัยเพื่อศึกษากโครงสร้างและหน้าที่ของเยื่อไขมันและการโต้ตอบกับโมเลกุลอื่นๆ ในอุตสาหกรรมเภสัชกรรม ช่วยในการพัฒนายาเป้าหมายไปยังโรคที่เกี่ยวข้องกับคอเลสเตอรอล เช่น หลอดเลือดแข็งตัวหรือคอเลสเตอรอลในเลือดสูง โครงสร้างที่เสถียรของมันยังทำให้มีคุณค่าในการศึกษาการสังเคราะห์และการย่อยสลายฮอร์โมนสเตียรอยด์