α-Chymotrypsin ถูกใช้อย่างแพร่หลายในด้านการแพทย์และชีวเคมีเนื่องจากกิจกรรมการย่อยโปรตีนของมัน ในด้านจักษุวิทยา ใช้ในการผ่าตัดต้อกระจกเพื่ออำนวยความสะดวกในการถอดเลนส์โดยการสลายเส้นใยโซนูลาร์ที่ยึดเลนส์ไว้ที่เดิม การทำงานของเอนไซม์นี้ทำให้ขั้นตอนง่ายขึ้นและลดความเสี่ยงของภาวะแทรกซ้อน ในงานวิจัย α-chymotrypsin ถูกใช้ในการศึกษากโครงสร้างและหน้าที่ของโปรตีน เนื่องจากมันตัดพันธะเปปไทด์อย่างเลือกเฉพาะที่กรดอะมิโนเฉพาะเจาะจง ช่วยในการจัดลำดับและวิเคราะห์โปรตีน นอกจากนี้ ยังใช้ในเทคนิคเพาะเลี้ยงเซลล์เพื่อแยกเนื้อเยื่อออกเป็นเซลล์เดี่ยวสำหรับวัตถุประสงค์ทางทดลอง ความสามารถในการย่อยสลายโปรตีนยังทำให้มีคุณค่าในกระบวนการอุตสาหกรรม เช่น การผลิตไฮโดรไลเซตโปรตีนสำหรับอาหารเสริมโภชนาการหรือผลิตภัณฑ์อาหาร